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生物大分子晶体学光束线/实验站(BL17U1)
上海光源生物大分子晶体学光束线/实验站(BL17U1)是一个基于真空室内波荡器的高亮度线站,主要用于研究生物大分子的三维空间结构,是从分子水平研究蛋白质等生物大分子结构与功能的主要手段,为我国结构生物学家提供了一个先进的实验平台。
 


BL17U1光束线及实验站主要设备

上海光源生物大分子晶体学光束线站(BL17U1)性能指标位居国际最好水平之列,该线站一经投入使用立即改变了我国结构生物学家以往主要依赖国外同步辐射装置开展前沿领域研究的局面。目前利用上海光源开展蛋白质晶体结构研究的课题组已达105个,占到国内在相关领域开展研究的课题组数量的90%以上。上海光源生物大分子晶体学光束线站的优异性能支撑我国用户在较短时间内收集了大量的实验数据,在具有重要生物学功能的蛋白质复合物、膜蛋白以及与流行疾病相关的蛋白质结构等结构生物学前沿领域取得了一批具有国际影响力的研究结果,发表在Cell、Nature及其子刊等国际顶级杂志上,促进我国结构生物学研究快速发展。以下是其中几个具有代表性的结构生物学研究成果。

重要蛋白质复合物结构研究
重要生物学过程中关键蛋白质复合物结构的研究,对于深入理解生物过程的机理起着关键的作用。清华大学结构生物学中心和中科院生物物理研究所相关研究组在上海光源的大力支持与配合下,在该领域研究取得了重要进展。
细胞凋亡(程序性细胞死亡,apoptosis)是在所有多细胞生物中起关键作用的基本生命过程,细胞凋亡的异常会导致严重病变,比如癌症、老年痴呆症等等。因此揭示细胞凋亡的分子机理不仅可以加深我们对这一基本生命过程的了解,还可以对开发新型抗癌、预防老年痴呆的药物提供线索。清华大学生命结构生物学中心施一公和颜宁领导的研究组成功解析了线虫细胞凋亡线性通路中的关键控制因子CED-4的晶体结构,初步揭示了CED-4调控CED-3的机理,并在此基础上提出了线虫细胞凋亡的分子模型,相关研究结果发表在Cell上(2010, 141, 446-457)。由于CED-4的晶体十分脆弱,分子量大,晶体衍射各向异性差别很大,要获得高质量的衍射数据,不仅对同步辐射光的性能如准直性、光斑尺寸、稳定性等有很高要求,而且由于晶体不适宜冷冻运输,最好能够在实验站附近生长晶体。该研究组曾先后多次去美、日同步辐射收集数据,都未能得到较高分辨的衍射数据。在上海光源生物大分子晶体学线站研究组的大力支持下,他们最终在上海光源成功地收集了CED-4的高质量衍射数据,获得了3.5埃分辨率的晶体结构。


细胞凋亡过程示意图

白细胞介素是由白细胞分泌的一类调节细胞生长、分化和免疫活性的细胞因子(interleukin;IL),在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用,此外它们还参与机体的多种生理及病理反应。白细胞介素1(IL-1)有两种形式的分子,分别是IL1α和IL-1。IL-1是一个重要的促炎细胞因子,它先与其靶细胞上受体IL-1RI 结合,然后与辅助受体IL-1RAcP作用形成IL-1/IL-1RI/IL-1RAcP三元复合物,激活靶细胞内的NF-B和MAPKs信号通路,从而诱导一系列炎症相关分子的表达。人体内IL-1的作用受到紧密的调控,其中在胞外和细胞膜上的调控作用由IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和诱饵受体IL-1RII所承担。IL-1Ra能与IL-1RI结合,但不能与IL-1RAcP作用;IL-1RII能与IL-1RI竞争IL-1的结合,同时还能够结合IL-1RAcP形成一个抑制性的IL-1/IL-1RII/IL-1RAcP三元复合物,这两个调控分子对IL-1的生物活性起着重要的负调控作用。很长一段时间以来,IL-1/IL-1RI是如何结合IL-1RAcP并激活受体复合物是IL-1研究领域一个亟待解决的基本问题,同时IL-1Ra发挥拮抗作用的结构基础也不是十分明了。清华大学结构生物学中心王新泉研究组利用上海光源BL17U1线站解析了IL-1,IL-1RII和IL-1RAcP所组成的抑制性三元复合物的晶体结构,以此为基础阐述了IL-1RAcP是如何与IL-1/IL-1RII相互作用,并通过进一步的定点突变和生化分析,揭示了IL-1结合并激活受体的结构机理以及IL-1Ra发挥拮抗作用的结构基础,研究结果发表在Nature Immunology (2010, 11: 905-911)。
Tudor结构域是一个由约50个氨基酸残基组成具有特定三维结构的motif。。Tudor蛋白广泛存在于生物体内,它的主要作用是结合含有甲基化氨基酸(包括甲基化赖氨酸和甲基化精氨酸)的蛋白质,通过与特定配体蛋白识别和结合在表观遗传、基因表达、小RNA调控、细胞分化等过程中发挥着重要作用。在生殖细胞系中,含有Tudor结构域的蛋白与甲基化的Piwi蛋白结合,通过piRNA途径调控生殖细胞的分化。中科院生物物理所许瑞明研究组在上海光源测定了果蝇Tud蛋白的第十一个extended-Tudor结构域Tud11的高分辨率晶体结构,发现果蝇Tud的extended-Tudor实际上折叠成SN-Tudor,但是氨基酸序列与先前报道的SN-Tudor同源性很低。通过表面等离子共振(SPR)筛选出与Tud11结合较强的两种含甲基化精氨酸的Aub多肽,并在上海光源测定了Tud11与这两种多肽的复合物晶体结构,揭示了Tudor结构域与甲基化精氨酸的结合方式,并发现一个在sDMA结合Tudor蛋白中保守的天冬酰胺残基与sDMA形成氢键。定点突变和等温滴定量热(ITC)实验进一步证明了该残基对于Tudor结合sDMA的重要性。该研究结果作为封面文章发表在Genes&Development发表的文章(2010,24(18):1962-1966)

膜蛋白结构研究
膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,在许多基本但重要的生物学功能中起关键作用,如光合作用、视觉、神经传递、发病机理、药物作用等。在基因组所编码的蛋白质中,大约30%是膜蛋白,在目前的药物开发中,有近50%的药物靶点为膜蛋白。膜蛋白结构是结构生物学研究中的重要问题之一,也一直是具有挑战性的难题。由于膜蛋白中包含的疏水基团使膜蛋白的晶体生长十分困难,很难得到有序性好、尺寸较大的晶体。目前已测定结构的膜蛋白数量很少,还不到已测定结构的蛋白质总数的百分之一。要在这一领域取得重大突破,能产生高亮度小光斑的高性能同步辐射光束线站是必不可少的,膜蛋白的结构研究正是上海光源BL17U1线站瞄准的目标之一。
借助上海光源BL17U1线站的优异性能以及可方便快捷利用的优点,清华大学结构生物学中心颜宁研究组在膜蛋白结构与功能方面大肠杆菌岩藻糖(L-fucose)转运蛋白(FucP)结构与功能研究上取得重要进展,在Nature(2010, 467: 734-738)发表题为"Structure of a fucose transporter in an outward-open conformation"的文章,报道大肠杆菌岩藻糖(L-fucose)转运蛋白(FucP)结构与功能的研究结果。 FucP从属于MFS(Major Facilitator Superfamily)超家族,MFS超家族转运蛋白是一类非常古老、在各个物种中都起着重要作用的转运蛋白,目前已知一级序列的家族成员超过一万个,它们在营养物质和代谢产物的转运、细菌抗药性以及神经信号传导等各种生理过程中起着重要作用。由于MFS转运蛋白的重要生理功能,它们的结构与功能受到了广泛的关注。然而迄今为止,这个家族中只有三个蛋白的结构被报道,并且观测到的仅有向胞内开放与两端封闭两种构象。一直以来,为了证明最基本的转运原理适用于MFS家族,迫切希望获得MFS转运蛋白向胞外开放的构象。他们的研究结果显示FucP处于向胞外开放的构象,这是第一个MFS家族的此类结构,原则上证明了MFS家族两个构象互变以转运底物的猜想。


FucP蛋白结构及表面静电势分布

流行病毒相关蛋白质结构研究
流感病毒是引起季节性、流行性流感和偶发的大流行的致病因子,病毒表面有两类重要的囊膜蛋白:血凝素(HA)与神经氨酸苷酶(NA)。HA负责识别宿主细胞表面的唾液酸受体,协助病毒囊膜与宿主细胞膜的融合,在病毒导入宿主细胞的过程中发挥重要作用。HA还具有免疫原性,抗HA的抗体可以中和流感病毒。NA则负责移去细胞受体和HA末端的唾液酸,有助于新生病毒粒子的释放和迁移,防止病毒聚集。研究这两类蛋白对于揭示特定病毒株的致病性、疫苗与药物研发等具有重要意义。
自2009年3月份甲型H1N1流感病毒在墨西哥暴发以来,各国科学家致力于对流感病毒表面两个重要蛋白血凝素(HA)和神经氨酸苷酶(NA)的研究,以解释该病毒传播致病的分子机制,为预防和控制其进一步传播提供科学依据。我国科学家也积极开展了该领域的相关研究。中国科学院微生物研究所高福研究组选取2009甲型H1N1流感病毒典型毒株A/California/04/2009(H1N1)的HA和NA作为研究对象,开展三维结构研究,该课题组先后5次到上海光源收集衍射数据,在国际上率先解析了2009甲型H1N1流感病毒HA和NA蛋白晶体结构。
对09HA结构的分析发现它与1918年大流行HA的整体结构以及抗原位点高度相似,与季节性流感差别很大,推测2009HA可被1918流感患者或病毒携带者的血清中和,该观点解释了年轻人对2009甲型H1N1流感易感,而老年人则有更强的抵抗力这一现象。
A型流感病毒的神经氨酸苷酶(NA)共有9个亚型,按照其一级序列可被分为两组:第1组和第2组。N1, N4, N5 和N8 被分为第1组, 而 N2, N3, N6, N7 和N9被归类为第2组。第1组NA的主要结构特点在于它的催化位点中有一额外的空洞,称为150-洞,根据这个特殊的150-洞可设计合成一些新型NA抑制剂。从系统发生角度分析,2009甲型H1N1毒株的NA属典型的第1组成员,但解析其晶体结构发现:与其它典型的第1组N1相比,2009NA没有这个"第1组NA特异性"的150-洞,由此推测针对150-洞的药物对于2009甲型H1N1流感病毒效率减弱甚至无效,这对于创新药物设计具有重要的指导意义。相关研究结果发表在Nature Structural & Molecular Biology(2010,17,166-1268)。

2009 甲型H1N1流感病毒囊膜蛋白神经氨酸酶(NA)的整体结构
此外,在禽流感病毒和SARS病毒相关蛋白酶结构研究方面,也取得了多项研究成果。

 
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